RESEARCH ARTICLES

SLEEP RESEARCH

Changes in the composition of brain
interstitial ions control the
sleep-wake cycle

Fengfei Ding,

1,2

* John O

Donnell,

1

* Qiwu Xu,

1

Ning Kang,

1

Nanna Goldman,

1

Maiken Nedergaard

1,3

Wakefulness is driven by the widespread release of neuromodulators by the ascending
arousal system. Yet, it is unclear how these substances orchestrate state-dependent,
global changes in neuronal activity. Here, we show that neuromodulators induce
increases in the extracellular K

+

concentration ([K

+

]

e

) in cortical slices electrically

silenced by tetrodotoxin. In vivo, arousal was linked to AMPA receptor

–independent

elevations of [K

+

]

e

concomitant with decreases in [Ca

2+

]

e

, [Mg

2+

]

e

, [H

+

]

e

, and the

extracellular volume. Opposite, natural sleep and anesthesia reduced [K

+

]

e

while

increasing [Ca

2+

]

e

, [Mg

2+

]

e

, and [H

+

]

e

as well as the extracellular volume. Local

cortical activity of sleeping mice could be readily converted to the stereotypical
electroencephalography pattern of wakefulness by simply imposing a change in the
extracellular ion composition. Thus, extracellular ions control the state-dependent
patterns of neural activity.

W

akefulness and sleep represent two fun-
damentally different behavioral states
(

1). While awake, we are responsive to

our surroundings, integrate sensory in-
put, recall memories, and make deci-

sions, whereas contact with the outside world is
limited during sleep. These two states of brain
activity show characteristic patterns of cortical
electroencephalography (EEG), gene expression,
and metabolic signature (

2, 3). The concerted

release of neuromodulators

—including norepi-

nephrine, acetylcholine, histamine, dopamine,
and orexin

—mediates arousal (4). All of these

neuromodulators individually alter the mem-
brane properties, spiking activity, and intra-
cellular signaling pathways of subpopulations
of neurons and glia (

5), but how they imple-

ment the striking stereotypic patterns of EEG
activity characterizing wakefulness versus sleep
is not understood (

6).

Neuronal excitability can be modulated by

changes in the composition of extracellular ions.
For example, moderate elevations of [K

+

] in the

bath solution (1 to 2 mM) increase spontaneous
and evoked excitatory activity in hippocampal
slices, and more robust elevations (2 to 5 mM)
trigger seizure-like activity (

7). Lowering extra-

cellular Ca

2+

([Ca

2+

]

e

) and extracellular Mg

2+

([Mg

2+

]

e

) also potently alters excitability (

7).

Neuromodulators increase extracellular
K

+

independently of synaptic activity

It is not known whether the changes in extra-
cellular ion concentrations that occur during
the natural sleep-wake cycle (

8) are primary or

secondary to alterations in electrical activity.
In fact, the changes in extracellular ions that
accompany behavioral states would be consid-
ered by most to be a consequence of different
patterns of neuronal activity. However, ion trans-
port is regulated by catecholamines outside
the central nervous system (CNS) (

5). We asked

whether neuromodulators also regulate ion
transport in the CNS and thereby the concen-
tration of extracellular ions. We first recorded
extracellular K

+

concentration ([K

+

]

e

) in corti-

cal slices prepared from adult mice using K

+

-

sensitive microelectrodes (K

+

-ISMs). Superfusion

of a cocktail of neuromodulators at a concen-
tration comparable with previous slice studies
containing norepinephrine, acetylcholine, do-
pamine, orexin, and histamine triggered a rapid
increase in [K

+

]

e

, averaging 0.43 ± 0.07 mM.

Surprisingly, blocking neuronal activity by ad-
dition of tetrodotoxin (TTX) (1

mM) neither al-

tered basal [K

+

]

e

nor significantly suppressed

the neuromodulator cocktail

–induced [K

+

]

e

in-

crease, despite completely blocking spontaneous
and evoked activity (Fig. 1). As a positive control,
we inhibited energy metabolism by short-lasting
exposure to the glycolytic inhibitor iodoacetate
(10 min, 3.5 mM), triggering an abrupt increase in
[K

+

]

e

, which partly recovered during washout

(Fig. 1F). As expected, TTX suppressed the in-
crease in [K

+

]

e

induced by inhibition of glycolysis

(

9). The insensitivity of neuromodulator-induced

[K

+

]

e

elevations to TTX raises the question as to

whether the concerted release of neuromodulators
during arousal and wakefulness also drives an
increase in [K

+

]

e

in vivo, and if so, whether this

elevation is upstream of excitatory transmission
or merely secondary to changes in local neuronal
activity.

Wakefulness triggers an increase in
extracellular K

+

that is independent of

AMPA receptors

We next measured state-dependent changes in
extracellular ion concentrations in vivo (fig. S2A).
All recordings were collected between zeitgeber
times (ZT) 4 and 8 (ZT times are based on a
24-hour diurnal cycle standardized so that ZT0
is the beginning of the sleep period and ZT12 is
the beginning of the awake period). Sleep was de-
fined as periods with high electrocorticography
(ECoG) delta activity and low electromyography
(EMG) activity relative to periods when animals
were awake. Starting from sleep, [K

+

]

e

rose rapidly

by 0.40 ± 0.05 mM (Fig. 2, A and B) as animals
awoke, before returning to baseline as animals
fell back asleep. These transitions occurred quickly,
with increases peaking within 1.3 ± 0.02 s (range
0.1 to 8.6 s,

n = 27 transitions), whereas the tran-

sition back to sleep was substantially slower and
more variable, 13.9 ± 2.7 s [range 1.8 to 45.9 s,
t(55) = 3.22, P = 0.002].

We next investigated the effect of isoflurane

anesthesia on [K

+

]

e

and collected recordings

during the animals

’ natural wake period (ZT16

to ZT20). After obtaining a stable awake [K

+

]

e

baseline, 2% isoflurane was administered, which
consistently triggered a sharp decrease in [K

+

]

e

of 0.37 ± 0.06 mM (Fig. 2C). This decrease in [K

+

]

e

remained stable throughout isoflurane adminis-
tration and recovered to pre-anesthesia awake
levels over 148 ± 41 s after cessation of anesthesia
(

n = 9 animals). Both the shift into and recovery

from anesthesia mirrored changes in ECoG and
EMG activity (Fig. 2C).

To critically evaluate the stability of state-

dependent ion shifts, microdialysis samples of
the extracellular fluid were collected in freely
behaving, unrestrained mice. We used the no-net
flux paradigm to estimate [K

+

]

e

, with five sam-

ples collected over several hours in which the
[K

+

] in artificial cerebrospinal fluid (ACSF) was

stepwise altered (Fig. 2D). Estimates of [K

+

]

e

were comparable with those recorded with K

+

-

ISMs in the cortex, 4.00 ± 0.17 mM versus 4.16 ±
0.09 mM in awake mice [

t(44) = 0.903, P = 0.371,

Student

’s t test]. Microdialysis also showed a sig-

nificant reduction in [K

+

]

e

during sleep and iso-

flurane periods, with values decreasing to 3.44 ±
0.11 mM in sleep and 3.26 ± 0.12 mM in isoflurane
(Fig. 2D).

To test whether state-dependent [K

+

]

e

shifts

are the result of changes in excitatory activity
in vivo, we applied the AMPA receptor antag-
onist 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX)
(200

mM). Although CNQX potently and rapidly

RESEARCH

550

29 APRIL 2016

• VOL 352 ISSUE 6285

sciencemag.org

SCIENCE

1

Center for Translational Neuromedicine, University of

Rochester Medical Center, Rochester, NY 14642, USA.

2

Department of Neurology, Tongji Hospital, Tongji Medical

College, Huazhong University of Science and Technology,
Wuhan 430030, China.

3

Center for Basic and Translational

Neuroscience, Faculty of Health and Medical Sciences,
University of Copenhagen, Copenhagen 2200, Denmark.

*These authors contributed equally to this work.

Corresponding

author: Email: nedergaard@urmc.rochester.edu

 on May 25, 2016

http://science.sciencemag.org/

Downloaded from 

suppressed the ECoG power of awake mice, only
a transient and short-lasting (<10 min) decrease
in [K

+

]

e

was observed, with [K

+

]

e

returning to

pre-CNQX concentrations despite continued sup-
pression of synaptic activity (fig. S2, B, C, and F).
Subsequent administration of isoflurane in the
presence of CNQX decreased [K

+

]

e

by 0.26 ±

0.02 mM (fig. S2C). Thus, regulation of [K

+

]

e

is de-

pendent on state-modulation and not a direct
measure of local glutamatergic activity. State-
dependent transitions in brain activity are also
linked to changes in the extracellular space vol-
ume (

10). Because the Na

+

- and K

+

-dependent

adenosine triphosphatase (Na

+

/K

+

-ATPase) is

the chief regulator of both [K

+

]

e

and cell vol-

ume (

7), we asked whether the decreased [K

+

]

e

in response to isoflurane anesthesia is linked to
expanded extracellular space. Despite markedly
reducing ECoG power throughout recordings,
CNQX neither changed awake extracellular space
nor inhibited isoflurane-induced expansion (fig.
S2E). This indicates that local synaptic trans-
mission (ECoG power) is not the primary de-

terminant of state-dependent changes of either
[K

+

]

e

or the extracellular space volume.

Together, cortical recordings of [K

+

]

e

as well

as sampling of the extracellular fluid by means
of microdialysis showed consistent decreases in
[K

+

]

e

as animals transitioned from the awake

state to sleep. Blocking local synaptic transmis-
sion with CNQX did not affect state-dependent
changes in [K

+

]

e

(Fig. 2E).

Extracellular Ca

2+

decreases

during wakefulness

Are cortical extracellular Ca

2+

concentrations

also regulated by the sleep-wake cycle? Oppo-
site to the rise in [K

+

]

e

, [Ca

2+

]

e

consistently de-

creased 0.13 ± 0.02 mM as mice transitioned
from sleep to awake states and, conversely, in-
creased by 0.11 ± 0.01 mM as the mice returned
to sleep (Fig. 3, A and B). These state-dependent
[Ca

2+

]

e

shifts were slow compared with those

of [K

+

]

e

, with sleep-to-awake transitions taking

51.5 ± 8.8 s [[Ca

2+

]

e

, 4.5 to 156.0 s, Student

’s t

test; versus [K

+

]

e

,

t(20) = 5.379, P < 0.0001] and

awake-to-sleep occurring over 63.3 ± 8.9 s [[Ca

2+

]

e

,

19.3 to 116.1 s, Student

’s t test; versus [K

+

]

e

,

t(16) =

6.696,

P < 0.0001]. Isoflurane administered to

awake mice drove a slow increase in [Ca

2+

]

e

throughout the duration of anesthesia, with levels
rising by 0.26 ± 0.02 mM (Fig. 3C). This rise in
[Ca

2+

]

e

continued throughout and past the ces-

sation of anesthesia, peaking at 1.2 ± 1.6 min
(

–6.2 to 12.4 min, n = 11 animals) and taking 22.6 ±

4.8 min (4.3 to 49.2 min,

n = 10 animals) to recover.

Microdialysis was used to assess the stability

of state-dependent [Ca

2+

]

e

shifts by using the

no-net flux method. Because of the slow time-
course of [Ca

2+

]

e

transitions and short awaken-

ings associated with sample collection, we pooled
sleep and awake samples and compared them
with isoflurane, finding that [Ca

2+

]

e

increases by

0.25 ± 0.08 mM under isoflurane anesthesia
(Fig. 3D), which is comparable with in vivo [Ca

2+

]

e

isoflurane recordings (Fig. 3E).

CNQX suppressed ECoG power by >60%

but did not alter awake [Ca

2+

]

e

or isoflurane-

induced [Ca

2+

]

e

increases (Fig. 3E), indicating

that local glutamatergic activity did not control
the shifts in [Ca

2+

]

e

. Together, all shifts from

awake to isoflurane-anesthetized states showed
surprising consistency (Fig. 3E). However, state-
dependent changes in [Ca

2+

]

e

could be secondary

to shifts in [K

+

]

e

. We therefore increased [K

+

]

e

in

the ACSF covering the cranial window from 2.8 to
4.5 mM, increasing [K

+

]

e

200

mm below the pial

surface by 0.47 ± 0.07 mM [Student

’s t test, t(7) =

6.861,

P < 0.0001]. However, imposing this in-

crease in [K

+

]

e

had no detectable effect on the

local [Ca

2+

]

e

concentration, suggesting that [Ca

2+

]

e

changes are not secondary to state-dependent [K

+

]

e

changes [paired

t test, t(2) = 0.855, P = 0.483].

Extracellular Mg

2+

is low during

wakefulness and increases during sleep
and anesthesia

In sleep and awake states, minor but consist-
ent shifts in free [Mg

2+

]

e

were identified, with

[Mg

2+

]

e

decreasing by 0.11 ± 0.01 mM (Fig. 4A)

as mice transitioned from sleep to awake and
increasing again by 0.13 ± 0.02 mM (Fig. 4B) as
animals were observed to return to sleep. Tran-
sitions occurred slowly from both sleep to awake
(68.9 ± 8.8 s; 5 to 342 s;

n = 55 transitions) and

awake to sleep (141.1 ± 14.8 s; 15.1 to 470 s;

n = 49

transitions). Isoflurane anesthesia also increased
[Mg

2+

]

e

by 0.44 ± 0.07 mM in awake mice (Fig.

4C) before gradually returning to baseline over
26.7 ± 5.7 min (9.6 to 66.3 min,

n = 9 animals)

after the cessation of anesthesia.

Microdialysis samples were collected during

the sleep (ZT2 to ZT8) and awake (ZT14 to ZT20)
periods and were pooled and compared with
isoflurane-induced shifts in [Mg

2+

]

e

, demonstrat-

ing an increase of 0.32 ± 0.13 mM [Mg

2+

]

e

in isoflu-

rane samples (Fig. 4D). CNQX neither altered basal
[Mg

2+

]

e

nor the previously observed isoflurane-

induced increase in [Mg

2+

]

e

(Fig. 4E). Thus, across

all experiments [Mg

2+

]

e

increased as mice went

from awake to sleep or isoflurane (Fig. 4E).

Robust changes in pH were also noted with iso-

flurane anesthesia. Recordings with pH-sensitive

SCIENCE

sciencemag.org

29 APRIL 2016

• VOL 352 ISSUE 6285

551

Fig. 1. Neuromodulators in-
crease [K

+

]

e

concentration

in the absence of neuronal
activity. (A) Representative
traces of [K

+

]

e

shifts before,

during, and after administer-
ing the neuromodulator cock-
tail. Scale bar,

x = 5 min, y =

0.2 mM [K

+

]

e

. (B) Thirty-second

binned averages of shifts be-
fore and after neuromodula-
tor cocktail. Arrow indicates
time of cocktail administration.

(C and D) Summary of [K

+

]

e

increase after neuromodulator cocktail application in slices ± TTX [paired

t test. (C) –TTX, t(11) = 5.871, P = 0.0001; (D) +TTX, t(21) = 11.69, P < 0.0001]. (Inset) Representative field
excitatory postsynaptic potential (fEPSP) recordings before and after application of TTX. Scale bar, 10 ms.
(E) Summarized shifts at 10 min after changing perfusion solution.

n = 6 cocktail-free ACSF, 12 cocktail, 10

ACSF+TTX, and 22 cocktail+TTX slices. One-way analysis of variance (ANOVA),

F(3,46) = 25.94, P < 0.0001.

Post-hoc Tukey test, **

P < 0.01, ***P < 0.001. (F) Representative trace of large [K

+

]

e

spike after metabolic

stress by using iodoacetate (IA).Trace includes pre-cocktail baseline, ACSF + cocktail, ACSF + IA, and return
to baseline ACSF. (Right) Magnified trace showing [K

+

]

e

increases in slices treated with the neuromodulator

cocktail (±TTX) followed by IA. Scale bars,

x = 5 min, y = 0.2 mM [K

+

]

e

. Mean (black circle) ± SEM.

RESEARCH

|

RESEARCH ARTICLES

 on May 25, 2016

http://science.sciencemag.org/

Downloaded from 

microelectrodes showed that pH decreased from
an awake level of 7.39 ± 0.03 to a stable isoflurane-
anesthetized level of 7.26 ± 0.02 (fig. S3).

Local manipulation of extracellular ions
controls neuronal activity and
extracellular space volume

Can interstitial ion composition be locally al-
tered to mimic natural sleep or awake concen-
trations? Because ions in the ACSF covering the
cranial window continuously exchange with those

in the interstitial fluid, we formulated awake-
inducing and sleep-inducing ACSFs (table S1)
to drive local cortex to the ionic composition of
the state opposite the overarching behavioral
state (fig. S4). In sleeping mice (ZT4 to ZT8),
the awake-inducing ACSF increased [K

+

]

e

by

0.47 ± 0.07 mM (versus 0.37 ± 0.06 mM in awake-
to-isoflurane transitions), decreased [Ca

2+

]

e

by

0.31 ± 0.06 mM (versus 0.26 ± 0.02 mM), and
decreased [Mg

2+

]

e

by 0.35 ± 0.02 mM (versus

0.44 ± 0.07 mM). Sleep-inducing ACSF applied

to cortex of awake mice (ZT16 to ZT20) resulted
in similar shifts, although in the opposite direc-
tion. Thus, both solutions could elicit local changes
in [K

+

]

e

, [Ca

2+

]

e

, and [Mg

2+

]

e

comparable with

those seen in transitions from awake to iso-
flurane anesthesia (fig. S4, B and D). It was not
possible to produce pH shifts of the magnitude
seen in awake-to-isoflurane transitions with
moderate changes in ACSF pH (

1 pH), likely

reflecting the efficacy by which CO

2

/HCO

3

system buffer pH (fig. S4, B and D) (

7).

552

29 APRIL 2016

• VOL 352 ISSUE 6285

sciencemag.org

SCIENCE

Fig. 2. Extracellular K

+

is higher during

wakefulness. (A and B) Representative
ECoG, [K

+

]

e

, and EMG recordings with a

data summary of state transitions in
(A) sleep-to-awake or (B) awake-to-sleep.
Initial [K

+

]

e

concentrations are shown to

the left, and the 1- to 4-Hz power is
displayed above so as to illustrate state-
dependent shifts, binned at 10 s for clarity.
n = 34 transitions; one-way, repeated mea-
sures ANOVA,

F(3,99) = 9.536, P < 0.0001.

Tukey post-hoc multiple comparisons test,
***

P < 0.001. Scale bar, x = 20 s, y = 0.1 mM

[K

+

]

e

; ECoG = 0.75 mV; EMG = 0.3 mV

(A) and 1 mV (B). (C) Representative
recording of awake-to-isoflurane transitions
recorded during the natural awake
period (ZT16 to ZT20);

n = 11 animals. One-

way repeated measures ANOVA,

F(2,20) =

35.61,

P < 0.0001. Post-hoc Tukey test,

***

P < 0.001. Scale bar, x = 1.5 min, y =

0.15 mM [K

+

]

e

, 0.75 mV EMG and ECoG.

(D) Microdialysis samples collected from freely moving mice during their awake (ZT14 to ZT20) or sleeping (ZT2 to ZT8) period, and under isoflurane
anesthesia. (Left) Schematic illustrating setup and inflow [K

+

] gradient, with representative ISM trace and sample no-net flux method plot used for [K

+

]

e

estimate. (Right) Summary of [K

+

]

e

by state.

n = 12 awake, 12 sleep, and 13 isoflurane animals. One-way ANOVA, F(2,34) = 8.055, P = 0.0014. Post-hocTukey

test, *

P < 0.05, **P < 0.01. (E) Comparison of all state-dependent transitions. One-way ANOVA comparing mean shifts by group, F(5,161) = 16.61, P < 0.0001.

Post-hoc Tukey test, *

P < 0.05, **P < 0.01. Mean (black circle) ± SEM.

Fig. 3. Extracellular Ca

2+

decreases dur-

ing wakefulness. (A and B) Representative
ECoG, EMG, and [Ca

2+

]

e

recordings in

(A) sleep-to-awake and (B) awake-to-sleep.
Initial [Ca

2+

]

e

is listed to the left with 1- to

4-Hz power presented above.

n = 28 tran-

sitions. One-way, repeated measures
ANOVA,

F(3,81) = 39.91, P < 0.0001. Post-

hoc Tukey test, ***

P < 0.001. Scale bars,

x = 20 s (A) and 40 s (B); y, [Ca

2+

]

e

=

0.05 mM, 0.75 mV EMG/ECoG. (C) Rep-
resentative recording of isoflurane in-
duction and recovery (ZT16 to ZT20) and
data summary.

n = 11 animals. One-way

repeated measures ANOVA,

F(2,20) = 18.52,

P < 0.0001. Post-hoc Tukey test, ***P <
0.001. Scale bar,

x = 6 min, y = [Ca

2+

]

e

=

0.2 mM, 0.5 mV EMG/ECoG. (D) Schematic
of microdialysis collection. Individual
sleep (light blue) and awake (gray) data
are pooled and compared with isoflurane.
n = 8 awake, 8 sleep, and 8 isoflurane
animals.Two-tailed

t test of isoflurane versus

non-isoflurane,

t(22) = 3.420, P = 0.003,

**

P < 0.01. (E) Comparisons of [Ca

2+

]

e

shifts from the awake-to-sleep, isoflurane, CNQX, and CNQX + isoflurane.

n = 8 animals; CNQX and CNQX + isoflurane one-

way ANOVA comparison of state-dependent shifts,

F(4,117) = 5.824, P = 0.0003; Post-hoc Tukey test, *P < 0.05, **P < 0.01. Mean (black circle) ± SEM.

RESEARCH

|

RESEARCH ARTICLES

 on May 25, 2016

http://science.sciencemag.org/

Downloaded from 

Can local manipulation of extracellular ions

in itself drive sleep- or awake-like patterns of
neuronal activity? We prepared mice with two
separate cranial windows located over the left
and right hemisphere and recorded ECoG sym-
metrically from each (Fig. 5A). Starting in sleep-
ing mice (ZT4 to ZT8) with sleep ACSF (table S1)
over each window, recordings were collected
from each hemisphere. After this baseline pe-
riod, the ACSF over the left window was re-
moved and replaced with awake-inducing ACSF.
When activity in the left hemisphere was nor-
malized to the right in order to preclude changes
from global state transitions, we observed a
34 ± 5% decrease in 1- to 4-Hz ECoG power after
application of awake-inducing ACSF, with no
change in activity in the contralateral hemisphere
(Fig. 5B). In comparison, natural sleep-to-wake
transitions decrease the 1- to 4-Hz power by 31.1
± 3.1% (mean ± SEM of all data,

n = 128 tran-

sitions). Conversely, could sleep-inducing ACSF
increase local delta power in awake mice? Rec-
ording between ZT16 and ZT20, awake mice
were prepared with awake ACSF covering each
cranial window. After a baseline recording, the
ACSF over the left hemisphere was replaced with
sleep-inducing ACSF, resulting in a 43 ± 13%
relative increase in 1- to 4-Hz delta power in the
left hemisphere exposed to the sleep-inducing
ACSF (Fig. 5C).

Because state-dependent changes in brain ac-

tivity are also linked to marked changes in the
extracellular space volume (

10), we asked whether

altering the local ion composition can drive ex-
tracellular space volume changes. Tetramethyl-
ammonium (TMA

+

) recordings showed that in

lightly anesthetized mice (1% isoflurane admin-

istered so as to avoid arousal episodes), changing
ACSF from sleep ACSF to awake-inducing in-
duced a 21.7 ± 1.2% decrease in the local extra-
cellular space volume (Fig. 5D). Tortuosity (

l)

was consistent with previous studies (

11). Con-

versely, the extracellular space volume increased
by 32.2 ± 2.9% from baseline recordings ob-
tained with awake ACSF to those recorded by
using sleep-inducing ACSF in awake mice, de-
spite mice remaining awake and mobile, with
tortuosity remaining unchanged (Fig. 5D).

Brain-wide manipulations of
extracellular ions can override
behavioral states

Would global manipulation of the extracellular
ion composition be sufficient to change the be-
havioral state of mice? We implanted EEG and
EMG electrodes, as well as a cannula in cisterna
magna (

10). In sleeping mice (ZT4), a baseline

recording was acquired by infusing sleep ACSF
followed by a switch to a modified awake-inducing
ACSF (Fig. 5E). This switch triggered a robust
change in EEG/EMG activity (Fig. 5E), with de-
creased EEG amplitude and delta prevalence
and increased EMG activity, indicative of an
awake-phenotype. Infusion rates were compa-
rable with CSF production, and ion concentra-
tions were chosen to account for total brain and
CSF volume (supplementary materials, materials
and methods). Typically, ACSF infusion itself did
not alter EEG activity (fig. S5, A and B). Mice
returned to sleep shortly after discontinuation
of awake-inducing ACSF infusion (Fig. 5F). We
next tested whether infusion of a modified sleep-
inducing ACSF could alter the behavioral state
of mice during their awake-period. Baseline

EEG/EMG activity characteristic of awake mice
was recorded while infusing awake ACSF fol-
lowed by a modified sleep-inducing ACSF. In-
fusion induced a sharp reduction in EMG activity
coupled to a marked increase in slow-wave EEG
activity, indicating a shift toward sleep. EEG/EMG
activity typical of wakefulness rapidly recovered
upon stopping infusion of the modified sleep-
inducing ACSF (Fig. 5G).

Discussion

Understanding what drives arousal is essential
for deciphering key aspects of consciousness
and the lack thereof during sleep and anesthe-
sia. We found that the transition from wake-
fulness to sleep is accompanied by a marked
and sustained change in the concentration of
key extracellular ions and the volume of the ex-
tracellular space. Arousal triggers a rapid rise
in [K

+

]

e

, combined with a decrease in [Ca

2+

]

e

,

[Mg

2+

]

e

, and [H

+

]

e

and a shrinkage of extra-

cellular space. Natural sleep or anesthesia in-
duces the inverse changes in extracellular ion
concentrations and is accompanied by an ex-
pansion of extracellular space volume. State-
dependent shifts in [K

+

]

e

occurred within seconds,

whereas the changes in [Ca

2+

]

e

and [Mg

2+

]

e

were

slow, taking 51.5 ± 8.8 s and 68.9 ± 8.8 s, respec-
tively, for sleep-to-awake transitions. Extracellu-
lar fluid samples from microdialysis confirmed
and extended the in vivo recordings by docu-
menting that state-dependent differences in
extracellular [K

+

]

e

, [Ca

2+

]

e

, and [Mg

2+

]

e

con-

centrations persisted over prolonged period of
hours in freely behaving animals (Figs. 2 to 4).
Microdialysis experiments suggested that state-
dependent changes in extracellular ions included

SCIENCE

sciencemag.org

29 APRIL 2016

• VOL 352 ISSUE 6285

553

Fig. 4. Extracellular Mg

2+

de-

creases during wakefulness.
(A and B) Representative state
transitions between sleep and
awake ECoG, EMG, and Mg

2+

-

sensitive microelectrodes, with
data summary. Initial [Mg

2+

]

e

is given to the left of the ISM
trace.

n = 73 sleep-to-awake

transitions (A) and 58 awake-to-sleep transitions (B).
One-way ANOVA,

F(3, 258) = 28.13, P < 0.0001. Post-

hoc Tukey test, ***

P < 0.001. Scale bars, x = 20 s, y =

0.05 mM [Mg

2+

]

e

, 0.33 mV EMG/ECoG. (C) Represent-

ative awake-to-isoflurane recording (ZT16 to ZT20)
and summary of changes.

n = 11 animals. One-way re-

peated measures ANOVA,

F(2,20) = 28.13, P < 0.0001.

Post-hoc Tukey test, *

P < 0.05, ***P < 0.001. Scale bar,

x = 5 min, y = 0.25 mM [Mg

2+

]

e

, 0.6 mV EMG/ECoG.

(D) Schematic of microdialysis collection with data
summary. Representative Mg

2+

-ISM and no-net flux

calculation are shown. Sleep (light blue) and awake
(gray) are pooled and compared with isoflurane.

n = 8

awake, 8 sleep, and 8 isoflurane animals. Two-tailed
t test of isoflurane versus pre-isoflurane, t(16) =
2.427,

P = 0.0274 (*P < 0.05). (E) Comparison of state-

dependent [Mg

2+

]

e

shifts from awake-to-sleep, isoflurane, CNQX, and awake + CNQX to isoflurane + CNQX.

n = 6 awake-to-CNQX animals and 6 awake +

CNQX-to-isoflurane + CNQX animals. One-way ANOVA of relative state-dependent shifts,

F(4,167) = 27.31, P < 0.0001. Post-hoc Tukey test, **P < 0.01, ***P <

0.001. Mean (black circle) ± SEM.

RESEARCH

|

RESEARCH ARTICLES

 on May 25, 2016

http://science.sciencemag.org/

Downloaded from 

widespread cortical areas because the samples
were collected by 2-mm-long probes.

All ions exhibited far more consistent, rapid

transitions during arousal relative to falling
asleep. This is consistent with the need to quickly
shift from sleep to awake states when presented
with novel, threatening, or unexpected stimuli,
and with the overarching ability of brainstem neu-
romodulatory centers to drive near-immediate
responses to behaviorally relevant events (

12).

Relative to [K

+

]

e

, the fivefold slower transition

of [Ca

2+

]

e

and [Mg

2+

]

e

may reflect differences

in the transport or buffering of these ions and
suggests that beyond the immediate capacity of
neuromodulators to drive quick arousal, it takes
longer for composition of interstitial ions to fully
stabilize. [Ca

2+

]

e

and [Mg

2+

]

e

exhibited very slow

recoveries after anesthesia, often lasting 10 to
30 min. Ions appeared to exhibit larger shifts
in the immediate post-induction and recovery
period. This biphasic activity may suggest a com-
plex shift in neuromodulatory activity during
these anesthetic transitions and, with [Ca

2+

]

e

and [Mg

2+

]

e

taking much longer than [K

+

]

e

to

return to a stable awake concentration, may re-
late to the confusion and postoperative delirium
that follows general anesthesia. In fact, high lev-
els of serum [Ca

2+

]

e

and [Mg

2+

]

e

can manifest as

subacute delirium (7).

Previous studies have shown that [Mg

2+

]

e

in the CNS is in the range of ~0.8 to 1.2 mM or

slightly lower than in plasma (

13, 14), but [Mg

2+

]

e

homeostasis has received little attention (

15).

In electrophysiological studies, manipulation of
[Mg

2+

]

e

is commonly used because low [Mg

2+

]

e

relieves the depolarization block of the

N-methyl-

D

-aspartate (NMDA) receptors and facilitates in-

duction of long-term potentiation (LTP) and, in
more extreme cases, seizure (

7, 16). Wakefulness

and sleep deprivation are linked to up-regulation
of pathways downstream of NMDA receptor ac-
tivation, including CamKII, extracellular signal

regulated kinase (ERK), and pCreb (

1, 17). The

decline in [Mg

2+

]

e

during wakefulness may there-

by, in combination with membrane depolariza-
tion induced by the elevation of [K

+

]

e

, contribute

to the gene expression pattern characteristic of
wakefulness. The finding that [Mg

2+

]

e

increases

during sleep is consistent with the observation
that changes in dietary magnesium can have a
profound impact on learning and memory, pos-
sibly by improving both the amount and quality
of sleep (

18, 19).

Arousal is triggered by the concerted activity

of neurons located in the brainstem, hypothal-
amus, and basal forebrain (

1, 4). Projections from

these clusters of neurons release norepinephrine,
acetylcholine, orexin, serotonin, dopamine, and
histamine over widespread areas of the CNS (

12).

Considerable redundancy exists in the system;
acute antagonism, ablation, or activation has
documented the importance of the individual

components in regulating arousal, but such per-
turbations rarely produce long-term effects (

12).

An unanswered question is how these neuro-
modulators drive global changes in EEG activity.
Conventional thinking is that the neuromodula-
tors alter the membrane properties and spiking
activity of select subtypes of neurons (

5). Our

findings show that a parallel path exists: A cock-
tail of neuromodulators consistently increased
[K

+

]

e

in cortical slices, and TTX did not signifi-

cantly suppress the [K

+

]

e

increase, suggesting

that this shift is not merely a consequence of
local synaptic activity. In vivo, inhibition of AMPA
receptors only transiently reduced [K

+

]

e

, with

levels returning to baseline in <10 min despite
continued suppression of ECoG activity by >60%
(Fig. 2E and fig. S2). This response to an exter-
nal challenge suggests that ionic homeostasis
is tightly regulated in a state-dependent, neu-
ronal activity

–independent manner. On the basis

of this, we propose that the neuromodulators

in addition to their well-documented, direct ef-
fect on neuronal activity

—maintain sleep and

awake states by creating a state-dependent set-
point for interstitial ion concentrations that
stabilize over seconds to minutes, minimizing
changes that result from transient burst firing or
suppression of these brainstem nuclei. In sleep
and anesthesia, lower concentrations of [K

+

]

e

will tend to hyperpolarize neurons, with high
[Ca

2+

]

e

and [Mg

2+

]

e

enhancing this effect through

554

29 APRIL 2016

• VOL 352 ISSUE 6285

sciencemag.org

SCIENCE

Fig. 5. Imposing changes in
extracellular ion concentra-
tions alter local activity,
extracellular space, and beha-
vioral state. (A) Schematic
of double-cranial window
recording setup. Symmetrically
positioned, separate cranial
windows over opposing somato-
sensory cortices were prepared
with ECoGs simultaneously
recorded in both hemispheres.
(B and C) Representative ECoG
recordings in (B) sleeping
(ZT4 to ZT8), and (C) awake
(ZT16 to ZT20) mice. (Top)
Representative recordings in
ACSF mimicking natural
state-dependent interstitial
ion composition. (Bottom)
Recordings after change of left-
hemisphere ACSF to (B) awake-
inducing or (C) sleep-inducing
ACSF. (Right) Summary of 1- to
4-Hz ECoG power shift in the left
hemisphere, normalized to the
right, after change to (B) awake-inducing or (C) sleep-inducing ACSF. Paired

t

test of 1- to 4-Hz power shifts, (A)

t(8) = 3.530, P = 0.008; (B) t(6) = 3.091, P =

0.0214. *

P < 0.05, **P < 0.01. Scale bar, x = 4 min, y = 10%. (D) TMA

+

traces of

shifts in extracellular space volume (

a) after switch from sleep to awake-

inducing ACSF (top trace) or awake to sleep-inducing ACSF (bottom trace).
Higher amplitude equals decreased dilution of TMA

+

and smaller extracellular

space. Data are summarized to the right. Paired

t test, awake-inducing, n = 16

animals;

t(15) = 11.04, P < 0.0001; sleep-inducing, n = 11 animals; t(10) = 8.95,

P < 0.0001, **P < 0.01. Scale bars, x = 2 min, y = 2 mV. (E) Schematic of cisterna-
magna infusion and wire EEG/EMG recording setup. (F and G) Representative
traces showing EEG and EMG activity before, during, and after a 0.3- to 0.5-

ml min

1

infusion of modified (F) awake-inducing or (G) sleep-inducing ACSF into the
cisterna magna. The 1- to 4-Hz relative power (percentage of 1 to 32 Hz) is
presented in averaged 10-min bins below. Infusion was run between (F) ZT5.5
and ZT7 (gray bar) and (G) ZT15 and ZT16.5 (purple bar) during sleep and
awake periods, respectively. Scale bar,

x = 30 min, y = 0.5 mV (F) and 1mV (G).

RESEARCH

|

RESEARCH ARTICLES

 on May 25, 2016

http://science.sciencemag.org/

Downloaded from 

surface-charge screening and inactivation of
the NALCN channel

–dependent Na

+

-leak cur-

rent (

20). High [Mg

2+

]

e

in combination with

hyperpolarization will reduce the likelihood of
NMDA receptor activation during sleep, reducing
the brain

’s ability to undergo activity-dependent

changes in excitatory transmission (LTP). Ma-
nipulation of [K

+

]

e

, [Ca

2+

]

e

, and [Mg

2+

]

e

in the

CSF bathing the brain drove behavioral shifts
between sleep and awake states (Fig. 5). Astro-
cytic Ca

2+

signaling is also enhanced by lowering

of [Ca

2+

]

e

and [Mg

2+

]

e

(

2123) and is strongly

inhibited by anesthesia (

24).These observations

suggest that regulation of extracellular ion ho-
meostasis is sufficient to alter behavioral state
both locally and globally, providing a path for
neuromodulators to exert consistent, stable
shifts in neuronal and astrocytic activity across
the brain.

A myriad of electrophysiological slice studies

have in the past taken advantage of minor mod-
ifications in the ion composition of the bath
solution to induce stable and highly reprodu-
cible changes in neural excitability. The observa-
tions presented here suggest that the CNS itself
uses the same trick to control state-dependent
changes in neuronal activity. One advantage of
this

“ionostatic control” of neural activity is to

provide a backdrop for coordinating shifts in be-
havioral state through the widespread regulation
of excitability without relying on complex recep-
tor activation in diverse subclasses of neurons.
The characteristic state-dependent pattern of
EEG activity can, at least in part, be explained
by differences in extracellular ion composition
in sleep versus wakefulness. Our observations
add new and critical insight into understanding
what drives arousal, as well as the loss of con-
sciousness during sleep and anesthesia. Future
studies should define whether changes in extra-
cellular ion concentrations are involved in dis-
orders such as stupor and coma.

R E FE R E N C ES A N D N OT ES

1.

G. Tononi, C. Cirelli, Neuron 81, 12

–34 (2014).

2. J. H. Benington, H. C. Heller, Prog. Neurobiol. 45, 347

–360

(1995).

3. V. Hinard et al., J. Neurosci. 32, 12506

–12517 (2012).

4. C. B. Saper, T. E. Scammell, J. Lu, Nature 437, 1257

–1263

(2005).

5. J. O

’Donnell, D. Zeppenfeld, E. McConnell, S. Pena,

M. Nedergaard, Neurochem. Res. 37, 2496

–2512

(2012).

6. M. Steriade, D. A. McCormick, T. J. Sejnowski, Science 262,

679

–685 (1993).

7. G. G. Somjen, Ions in the Brain: Normal Function, Seizures,

and Stroke (Oxford Univ. Press, 2004).

8. J. Seigneur, D. Kroeger, D. A. Nita, F. Amzica, Cereb. Cortex 16,

655

–668 (2006).

9. S. M. Rothman, Science 220, 536

–537 (1983).

10. L. Xie et al., Science 342, 373

–377 (2013).

11. M. And

ěrová et al., Glia 35, 189–203 (2001).

12. C. B. Saper, P. M. Fuller, N. P. Pedersen, J. Lu, T. E. Scammell,

Neuron 68, 1023

–1042 (2010).

13. A. J. Hansen, Physiol. Rev. 65, 101

–148 (1985).

14. L. Sun et al., Magnes. Res. 22, 266

–272 (2009).

15. A. M. Romani, Arch. Biochem. Biophys. 512, 1

–23

(2011).

16. W. W. Anderson, D. V. Lewis, H. S. Swartzwelder, W. A. Wilson,

Brain Res. 398, 215

–219 (1986).

17. G. F. Gilestro, G. Tononi, C. Cirelli, Science 324, 109

–112

(2009).

18. B. Abbasi et al., J. Res. Med. Sci. 17, 1161

–1169 (2012).

19. I. Slutsky et al., Neuron 65, 165

–177 (2010).

20. B. Lu et al., Neuron 68, 488

–499 (2010).

21. J. Schummers, H. Yu, M. Sur, Science 320, 1638

–1643 (2008).

22. H. Sontheimer, Glia 11, 156

–172 (1994).

23. A. Torres et al., Sci. Signal. 5, ra8 (2012).
24. A. S. Thrane et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109,

18974

–18979 (2012).

AC K N OW L E D G M E N TS

This study was supported by NIH (NS078167 and NS078304)
and the Office of Naval Research/Department of the Navy. We
thank W. Song, R. Rasmussen, E. Nicholas, and W. Peng for

expert technical assistance and C. Cirelli, G. Tononi, W. Wang,
and C. Nicholson for comments on the manuscript. All authors
contributed to data collection, technical design, and writing.

SUPPLEMENTARY MATERIALS

www.sciencemag.org/content/352/6285/550/suppl/DC1
Materials and Methods
Figs. S1 to S5
Table S1
References (25

–45)

18 September 2015; accepted 24 March 2016
10.1126/science.aad4821

REPRODUCTIVE BIOLOGY

Unconventional endocannabinoid
signaling governs sperm activation
via the sex hormone progesterone

Melissa R. Miller,

1

Nadja Mannowetz,

1

Anthony T. Iavarone,

2

Rojin Safavi,

1

Elena O. Gracheva,

3

James F. Smith,

4

Rose Z. Hill,

1

Diana M. Bautista,

1

Yuriy Kirichok,

5

Polina V. Lishko

1

*

Steroids regulate cell proliferation, tissue development, and cell signaling via two
pathways: a nuclear receptor mechanism and genome-independent signaling.
Sperm activation, egg maturation, and steroid-induced anesthesia are executed via the
latter pathway, the key components of which remain unknown. Here, we present
characterization of the human sperm progesterone receptor that is conveyed by the
orphan enzyme

a/b hydrolase domain–containing protein 2 (ABHD2). We show

that ABHD2 is highly expressed in spermatozoa, binds progesterone, and acts as
a progesterone-dependent lipid hydrolase by depleting the endocannabinoid
2-arachidonoylglycerol (2AG) from plasma membrane. The 2AG inhibits the sperm
calcium channel (CatSper), and its removal leads to calcium influx via CatSper
and ensures sperm activation. This study reveals that progesterone-activated
endocannabinoid depletion by ABHD2 is a general mechanism by which progesterone
exerts its genome-independent action and primes sperm for fertilization.

A

ccording to the conventional model of
steroid signaling, steroid hormones act
through their corresponding genomic re-
ceptors to regulate gene expression in de-
velopment, metabolism, and reproduction

(

1, 2). The time scale of these signaling events

ranges from hours to days (

2). However, there

is a much faster pathway that alters ion chan-
nel activity through steroid activation of mem-
brane receptors. Nongenomic signaling of the
steroid hormone progesterone (P4) occurs on a
time scale of seconds and is required for dis-
tinct physiological events, such as oocyte matu-

ration (

3) and human sperm cell activation (4, 5),

and P4 likely triggers anesthesia in rodents (

6).

Many tissues have both nuclear and membrane
progesterone receptors, which complicates iden-
tification of the latter. Because sperm are tran-
scriptionally silent cells and, therefore, lack the
nuclear progesterone receptor effect, we used
human spermatozoa as a cellular model to iden-
tify the nongenomic progesterone receptor.

Progesterone is a major component of follic-

ular fluid and is released by ovaries and cumu-
lus cells that surround the oocyte. Nanomolar
concentrations of P4 act through the nongenomic
P4 receptor pathway and cause robust elevation
of sperm cytoplasmic [Ca

2+

] (

7–9) through the

activation of the cation channel, CatSper (

10–14).

This rise in intracellular [Ca

2+

] leads to changes

in sperm motility, known as hyperactivation, and
primes sperm for acrosomal exocytosis (

4, 5, 15).

Here, we show that the orphan enzyme

a/b hy-

drolase domain

–containing protein 2 (ABHD2)

serves as a sperm progesterone receptor. It func-
tions as a lipid hydrolase by removing endogenous
CatSper inhibitors upon association with P4. Thus,

SCIENCE

sciencemag.org

29 APRIL 2016

• VOL 352 ISSUE 6285

555

1

Department of Molecular and Cell Biology, University of

California, Berkeley, CA 94720, USA.

2

QB3/Chemistry Mass

Spectrometry Facility, University of California, Berkeley, CA
94720, USA.

3

Department of Cellular and Molecular

Physiology; Department of Neuroscience, Program in Cellular
Neuroscience, Neurodegeneration, and Repair (CNNR), Yale
School of Medicine, Yale University, New Haven, CT 06536,
USA.

4

Department of Urology, University of California, San

Francisco, CA 94143, USA.

5

Department of Physiology,

University of California, San Francisco, CA 94158, USA.

*Corresponding author. Email: lishko@berkeley.edu

RESEARCH

|

RESEARCH ARTICLES

 on May 25, 2016

http://science.sciencemag.org/

Downloaded from 

 (6285), 550-555. [doi: 10.1126/science.aad4821]

352

Science 

Goldman and Maiken Nedergaard (April 28, 2016) 

Fengfei Ding, John O'Donnell, Qiwu Xu, Ning Kang, Nanna

sleep-wake cycle

Changes in the composition of brain interstitial ions control the

 

Editor's Summary

 

 

 

, this issue p. 550; see also p. 517

Science

thus be a cause, rather than a consequence, of sleep/wake-dependent changes in neuronal activity.

interstitial ion levels could switch a brain from wakefulness to sleep. Changes in extracellular ions may 

direct effects of the neuromodulators on extracellular ion composition. However, these changes in

by Landolt and Holst). This influence was not driven by changes in local neuronal firing, suggesting 

Perspective

modulatory neurotransmitters influenced the levels of extracellular ions in the brain (see the 

 found that a combination of

et al.

How do we switch from sleep to arousal and back? Ding 

Sleep induction through ion changes

This copy is for your personal, non-commercial use only. 

Article Tools

http://science.sciencemag.org/content/352/6285/550

article tools: 

Visit the online version of this article to access the personalization and

Permissions

http://www.sciencemag.org/about/permissions.dtl

Obtain information about reproducing this article: 

 is a registered trademark of AAAS. 

Science

Advancement of Science; all rights reserved. The title 

Avenue NW, Washington, DC 20005. Copyright 2016 by the American Association for the

in December, by the American Association for the Advancement of Science, 1200 New York 

(print ISSN 0036-8075; online ISSN 1095-9203) is published weekly, except the last week

Science 

 on May 25, 2016

http://science.sciencemag.org/

Downloaded from