1

 

 

Melatonin dietary supplement as an anti-aging therapy for age-related 

bone loss 

Tresguerres Isabel F

1

*, Tamimi Faleh

2

, Eimar Hazem

3

, Barralet Jake E

4

, Prieto 

Santiago

5

, Torres Jesús

6

, José Luis Calvo-Guirado

7

, Tresguerres Jesús AF

8

 

1.  Assistant  Professor.  MD.  PhD.  DDS.  Department  of  Medicine  and  Oral  Surgery.  School  of 

Dentistry. Complutense University, Madrid, Spain. isabelfe@ucm.es 

2.  Assistant  Professor.  PhD.  BDS.  Faculty  of  Dentistry,  McGill  University,  Montreal,  Canada. 

faleh.tamimimarino@mcgill.ca 

3.  PhD  Student.  MSc.  BDS.  Faculty  of  Dentistry,  McGill  University,  Montreal,  Canada. 

hazem.eimar@mcgill.ca 

4.  Full  Professor.  DDS.  PhD.  Faculty  of  Dentistry,  McGill  University,  Montreal,  Canada. 

jake.barralet@mcgill.ca 

5.  Assistant  Professor.  MD,  PhD.  School  of  Medicine.  Complutense  University,  Madrid,  Spain. 

Clinical practice in the Doce de Octubre Hospital. s_prieto@telefonica.net 

6.  Assistant Professor. DDS. PhD. Department of Medicine and Oral Surgery. School of Dentistry. 

Complutense University, Madrid, Spain. chustg@yahoo.es 

7.  Associate  Professor.  DDS.  PhD.  Department  of  General  and  Implant  Dentistry.  School  of 

Medicine and Dentistry. Murcia University. Murcia. Spain. joseluis.calvo@um.es 

8.  Full  Professor.  MD.  PhD.  Departament  of  Physiology.  School  of  Medicine.  Complutense 

University, Madrid, Spain. guerres@med.ucm.es 

address  for  correspondence  and  reprints:  Department  of  Medicine  and  Oral  Surgery,  School  of 

Dentistry.  Complutense  University,  Madrid,  Spain.  Plaza  Ramón  y  Cajal  s/n,  28040  Madrid,  Spain. 

Tel: +34 913941484; 696569331; e-mail: isabelfe@ucm.es. 

Word count: 1947 

Key words: melatonin, aging, rats, bone mass, micro-CT scan, biomechanical properties 

Abbreviated tittle: Effects of melatonin on age-related bone loss 

 Page 1 of 26 

Rejuvenation Research

Melatonin dietary supplement as an anti-aging therapy for age-related bone loss (doi: 10.1089/rej.2013.1542)

This article has been peer-reviewed and accepted for publication, but has yet to undergo copyediting and proof correction. The final published version may differ from this proof.

2

 

 

Abstract 

Introduction:  Previous  studies  have  shown  that  melatonin,  an  antioxidant  molecule  secreted 

from the pineal gland, is a positive regulator of bone mass. However, melatonin potential effects 

on bone mass have never been investigated in old population  yet.  The aim of this study was to 

assess  the  effects  of  dietary  melatonin  supplementation  on  mass  accrual  and  biomechanical 

properties of old rat femora. 

Methods:  Twenty  22-months-old  male  Wistar  rats  were  divided  into  2  randomly  assigned 

groups. The first group was treated for 10 weeks with melatonin, whereas the second group left 

untreated  (control).  Rat  femurs  were  collected,  and  their  phenotypes  and  biomechanical 

properties  were  investigated  by  micro-computed  tomography,  histomorphometry  and  3-point-

bending  test.  Statistical  analyses  were  performed  by  Student’s  two-tailed  unpaired  t-test.  In  all 

experiments, a value of p < 0.05 was considered significant. 

Results:  Rats  treated  with  melatonin  had  higher  bone  volume,  bone  trabecular  number, 

trabecular  thickness  and  cortical  thickness  in  comparison  to  control  group.  Histomorphometric 

analyses  confirmed  the  increase  of  bone  volume  in  melatonin-treated  rats.  In  agreement  with 

these findings, melatonin-treated rats demonstrated with higher bone stiffness, flexural modulus 

and ultimate load compared to controls. 

Conclusion:  These  compelling  results  are  the  first  evidence  indicating  that  dietary  melatonin 

supplementation  is  able  to  exert  beneficial  effects  against  age-related  bone  loss  in  old  rats; 

improving the microstructure and biomechanical properties of aged bones.  

 

 

 

Page 2 of 26 

Rejuvenation Research

Melatonin dietary supplement as an anti-aging therapy for age-related bone loss (doi: 10.1089/rej.2013.1542)

This article has been peer-reviewed and accepted for publication, but has yet to undergo copyediting and proof correction. The final published version may differ from this proof.

3

 

 

Introduction: 

Bone tissue consists of an inorganic phase (~65%) and an organic phase (~35%)

1

. Bone 

hosts  distinct  cell  types  such  as  osteoblasts,  osteocytes,  osteoclasts  and  mesenchymal  stem 

cells

1,2

. Bone undergoes  a  remodeling  process  where mature bone is  removed by  osteoclasts  (a 

process called bone resorption) and replaced by new bone by osteoblasts (a process called bone 

formation)

1

. In normal physiological conditions, bone remodeling is coupled tightly to maintain a 

steady state between bone resorption and bone formation

3

. With increasing in age, bone capacity 

to respond to different stimuli that promotes bone mass (such as vitamin D, growth hormone and 

IGF-I) decreases

4,5

. Indeed, aging bone has been shown to suffer from a reduction in stem cells 

differentiating into osteoblasts, an increase in bone marrow adiposity as well as a longer life span 

for mature osteoclasts

6

. These age-related changes shift the balance of bone remodeling towards 

bone  resorption,  leading  to  a  substantial  decrease  in  both  bone  quality  and  mechanical 

properties

6

.  

Interestingly, age-related bone changes occur alongside the observed decline in function 

of  the  neuroendocrine  system

7

.  One  of  the  neuroendocrine  hormones  that  declines  with  age  is 

melatonin

8

.  Melatonin,  a  very  powerful  broad  spectrum  antioxidant  molecule

9

,  is  synthesized 

from serotonin at the pineal gland

10

. Melatonin binds to its membrane-bound G protein-coupled 

receptors:  MT1  and  MT2,  which  are  widely  distributed  in  body  tissues

11

,  including  both 

osteoblasts and osteoclasts

12

.  

Melatonin  is  known to  control body circadian  rhythm

13

, body core temperature

14

, blood 

pressure

15

,    immune  system

16

  as  well  as  both  bone  remodeling  arms:  bone  formation  and  bone 

resorption

17

. Moreover, previous research suggested a possible role of melatonin in the process 

 Page 3 of 26 

Rejuvenation Research

Melatonin dietary supplement as an anti-aging therapy for age-related bone loss (doi: 10.1089/rej.2013.1542)

This article has been peer-reviewed and accepted for publication, but has yet to undergo copyediting and proof correction. The final published version may differ from this proof.

4

 

 

of  aging

18

,  and  thus  melatonin  supplements  might  act  as  an  anti-aging  therapy  for  age-related 

body  changes  including  the  immune,  cardiovascular  and  nervous  systems

19-21

.  However,  the 

potential role of melatonin supplement as an anti-aging therapy for age-related bone changes has 

never  been  investigated  yet.  One  interesting  finding  that  links  melatonin  to  age-related  bone 

changes  is  that  as  melatonin  secretions  and  MT1  receptors  expression  by  osteoblasts  tend  to 

decline with age, similarly to bone mass accrual

22,23

. 

All  these  linking  findings  indicate  that  melatonin  supplement  might  be  act  as  an  anti-

aging  therapy  for  bone  deteriorations  in  old  population.  Accordingly,  here  we  have  conducted 

this in vivo study in which we investigated the effects of dietary supplementation of melatonin on 

architecture and biomechanical properties of old rats bones.  

Materials and Methods: 

Animals 

All  experimental  procedures  of  this  study  were  performed  following  the  guidelines  for 

Ethical  Care  of  Experimental  Animals  of  the  European  Union,  approved  by  the  Ethical 

Committee  for  Animal  Studies  of  the  Complutense  University  (Madrid,  Spain).  Twenty  22-

months-old male Wistar rats were used in this study. All animals were housed in polycarbonate 

cages, subjected to a 12-h light–dark cycle at the constant temperature of 23º

C and fed a standard 

laboratory  rat  diet  (A.O4  Panlab,  Barcelona,  Spain)  and  water  ad  libitum.  Rats  were  randomly 

divided  into  two  assigned  groups  (n  =  10).    The  first  group  of  rats  was  treated  with  melatonin 

diluted  in  drinking  water  at  dosages  of  10  mg/Kg/day.  Melatonin  was  dissolved  in  absolute 

ethanol and added to the drinking water in a final concentration of 0.066%. Water bottles were 

covered  with  aluminum  foil  to  be  protected  from  light.  The  second  group  of  rats  were  left 

 

Page 4 of 26 

Rejuvenation Research

Melatonin dietary supplement as an anti-aging therapy for age-related bone loss (doi: 10.1089/rej.2013.1542)

This article has been peer-reviewed and accepted for publication, but has yet to undergo copyediting and proof correction. The final published version may differ from this proof.

5

 

 

untreated as a control (only water and vehicle-treated). After 10 weeks of treatment, the animals 

were sacrificed  by decapitation.  Rat  femurs were collected  and fixed in  buffered  formaldehyde 

for further analyses. 

Micro-CT scan analysis  

Micro  CT  analyses  were  performed  as  previously  described

24

.  Briefly,  proximal  right 

femur  of  each  rat  was  analyzed  by  3D-micro  CT  at  X40  magnification  with  a  SkyScan  1072 

(Bruker-Microct,  Kontich,  Belgium)  and  using  bone-analysis  software  (Version  2.2f,  Skyscan, 

Kontich, Belgium). Parameters were acquired with a rotation of 0.7 degree between each picture 

with the X-ray source set at 100

  kV and 98  µA. The segmentation of the image was made by a 

global threshold and a voxel size of 21.90

  ×  21.90  ×  21.90  µm; the same threshold setting 

was used for all the samples. The following 3D morphological parameters were evaluated for the 

20  femurs:  bone  volume  fraction  (BV/TV),  trabecular  thickness  (Tb.Th),  trabecular  number 

(Tb.N) and cortical thickness (Ct.Th)

25

.  

Bone histology 

Twenty  rats  left  femurs  were  fixed  for  24  hr  in  n  4%  PFA/PBS,  dehydrated  in  graded 

ethanol  series  before  being  embedded  in  methyl  methacrylate  resin  according  to  standard

26

Undecalcified  sections  of  the  embedded  rats  femurs  were  stained  by  basic  fuchsin  methylene 

blue. Bone volume-to-tissue volume ratio (BV/TV) was measured on seven-micrometer sections.  

Mechanical testing 

A  three-point  breaking  test  was  performed  on  the  midshaft  of  the  20  right  femurs 

obtained  from  all  mice  as  previously  described

24,27

.  Briefly,  a  commercial  bench-mounted 

vertical  tensile/  compression  tester  (Instron  5569,  Instron  Corp.,  Canton,  MA)  was  used.  The 

span of two support points was 20 mm, and the deformation rate was 0.1 mm/min. The extrinsic 

 Page 5 of 26 

Rejuvenation Research

Melatonin dietary supplement as an anti-aging therapy for age-related bone loss (doi: 10.1089/rej.2013.1542)

This article has been peer-reviewed and accepted for publication, but has yet to undergo copyediting and proof correction. The final published version may differ from this proof.

6

 

 

parameters:  young  modulus  and  stiffness  were  calculated  from  the  resulting  load-displacement 

curves.  Stiffness  is  a  measure  of  resistance  of  bone  to  displacement;  Young’s  modulus  is  a 

measure of stiffness related to the shape of the object; ultimate force is the maximum force that 

bone can resist; work to failure is the energy required to break bone. 

Statistical analyses 

All  results  are  shown  as  descriptive  outcomes  (mean  ±  standard  deviation).  Normal 

distribution of data  was checked  by  the Shapiro-Wilks  statistical  test.  Statistical  analyses  were 

performed by Student’s  two-tailed unpaired t-test.  In all experiments,  a  value of p  < 0.05 was 

considered significant as indicated by a single asterisk. 

Results 

Melatonin  treatment  favors  bone  mass,  bone  microarchitecture  and  bone  biomechanical 

properties 

We examined bone structural parameters by 3D Micro CT of rats treated with melatonin 

and those left untreated (control). In figure 1 and 2, rats treated with melatonin had higher bone 

volume (BV/TV=30.9±4.6%), bone trabecular number (Tb.N=9.6±0.6/mm), trabecular thickness 

(Tb.Th=0.8±0.2mm) and cortical thickness (Ct.Th=0.5±0.1mm) in comparison to control  group 

(BV/TV=25.0±3.7%; 

Tb.N=8.3±0.5/mm; 

Tb.Th=0.6±0.1mm; 

Ct.Th=0.4±0.1mm). 

Histomorphometric  analyses  confirmed  the  increase  of  bone  volume  in  melatonin-treated  rats 

(BV/TV=32.5±1.1%)  compared  to  control  (BV/TV=27.3±1.4%,  Figure  3).  Analysis  of  bone 

mechanical  properties  showed  higher  bone  stiffness  (453±155N/mm),  flexural  modulus 

(2182±1084N/mm

2

)  and  ultimate  load  (181±50N)  in  melatonin-treated  rats  than  in  controls 

(Stiffness=307±75N/mm; Flexural modulus=1332±976N/mm

2

; ultimate force= 148±36N, Figure 

 

Page 6 of 26 

Rejuvenation Research

Melatonin dietary supplement as an anti-aging therapy for age-related bone loss (doi: 10.1089/rej.2013.1542)

This article has been peer-reviewed and accepted for publication, but has yet to undergo copyediting and proof correction. The final published version may differ from this proof.

7

 

 

4). However, femurs of melatonin-treated rats did not exhibit a significant improvement in work 

to failure (300±147N*mm) compared to control (244± 126N*mm).  

Discussion: 

Aging is associated with a reduction in the function of most physiological systems of the 

organism, including bone. Age-related bone changes  are  characterized  by  deterioration  of  bone 

architecture,  loss  of  bone  mass  and  increase  in  susceptibility  to  fractures

6,28

, and  it  is  a  serious 

public health problem in the aging population

29

. Accordingly, several studies were conducted to 

find  new  therapeutic  approaches  to  prevent  or  to  slow  down  age-related  bone  deterioration. 

Nowadays,  the only approved drugs  that are commonly prescribed to  improve  bone quality are 

Bisphosphonates,  Denosumab,  Parathyroid  Hormone,  Selective  Estrogen  Receptor  Modulators 

and Estrogen/Progesterone Hormone therapy

30

. However, even though these drugs are successful 

therapies for age-related bone changes and diseases, their use is limited due to the high cost and 

side effects

31-36

. In our study and for the first time, we provided the first evidence for the effects 

of melatonin as an anti-aging therapy for age-related bone changes.  

The  chronic  treatment  with  10  mg/kg/day  of  melatonin  for  10  weeks  involves  the  oral 

intake of high amounts of melatonin. Our group has been studying effects of melatonin on aging-

related  parameters  since  nearly  twenty  years,  such  as  oxidative  stress,  inflammation  and 

apoptosis  on  several  organs  like  heart

37,38

,  pancreas

39

,  liver

40,41

,  and  brain

42

.  The  influence  of 

different  doses  of  melatonin  (1  mg/kg/day  to  50  mg/kg/day)  on  different  organs  has  also  been 

studied.  Since  10  mg/kg/day  had  showed  more  beneficial  effects  on  pancreas

39

,  and  heart

37,38  

than 1 mg/kg/day, we thought that 10 mg/kg/day of melatonin should be more effective on bone 

than 1 mg/kg/day. 

 Page 7 of 26 

Rejuvenation Research

Melatonin dietary supplement as an anti-aging therapy for age-related bone loss (doi: 10.1089/rej.2013.1542)

This article has been peer-reviewed and accepted for publication, but has yet to undergo copyediting and proof correction. The final published version may differ from this proof.

8

 

 

Melatonin  was  diluted  in  the  drinking  water,  according  to  previous  papers

37-42

.  Rats  are 

night-time  animals.  During  the  day  they  normally  sleep,  so  more  than  90%  of  the  total  daily 

water is drunk during the night.  

 

Male animals have been used in this study and in the majority of our experiments

37-40,42

Male rats are not dependent of cycle variations and represent a well established model of aging.  

Melatonin supplement favors bone mass accrual in old rats  

This study was conducted on 22-months-old rats which is equivalent to 60 years of age in 

humans

43

. Following 10 weeks of treatment with melatonin (treated group), which is equivalent 

to  6  years  in  human  age

43

,  versus  those  left  untreated  (control),  femur  bone  phenotype  was 

analyzed by micro CT-scan, histology and biomechanically.  

Micro  CT-scan  provided  additional  advantages  over  classical  densitometers  such  as 

DXA, the most popular tool to measure bone mineral density. Indeed, micro CT-scan is able to 

measure  separately  cortical  and  trabecular  tissues,  while  DXA  measure  the  addition  of  them, 

trabecular plus cortical, without discriminating both tissues

44

. In our study, melatonin-treated old 

rats  expressed  higher  bone  volume,  trabecular  number  and  larger  trabecular  and  cortical 

thickness  compared  to  control.  Findings  from  micro-CT  analyses  were  also  confirmed  by 

histomorphometric  analyses.  The  results  of  this  study  are  in  agreement  with  previous  studies 

conducted on  young mice

23,45

. In which, daily intraperitoneal injections of melatonin were able 

to significantly enhance BMD in mice tibiae

45

 and enhance cortical thickness

23

.  

Biomechanical  properties  of  rats  femurs  collected  from  our  experiments  were  analyzed 

by  three-point  bending  test,  the  most  popular  method  for  the  characterization  of  long  bone 

biomechanical  properties

46

.  Melatonin-treated  rats  demonstrated  with  higher  biomechanical 

 

Page 8 of 26 

Rejuvenation Research

Melatonin dietary supplement as an anti-aging therapy for age-related bone loss (doi: 10.1089/rej.2013.1542)

This article has been peer-reviewed and accepted for publication, but has yet to undergo copyediting and proof correction. The final published version may differ from this proof.

9

 

 

properties  than  those  rats  left  untreated  (control  group).  Our  results  are  in  agreement  with 

previous  studies,  in  which  it  has  been  shown  that  melatonin  treatment  is  able  to  improve  bone 

mechanical properties in young animals

47,48

. However, to the best of our knowledge our study is 

the  first  evidence  demonstrating  that  melatonin  treatment  improves  bone  biomechanical 

properties in old animals.  

Mechanism by which melatonin favors bone mass accrual  

Melatonin  has  been  proposed  to  affect  the  bone  formation  arm  of  the  bone  remodel 

model

17,23,49-52

In vitro studies have shown that melatonin regulates the mesenchymal stem cells 

(MSCs)  differentiation  towards  osteogenic  lineage,  rather  than  adipogenic  lineage

49

,  by 

enhancing the expression of runt-related transcription factor 2 (Runx2) and bone morphogenetic 

protein  (BMP)-2  and  BMP-4,  thereby  affecting  the  Wnt  signaling  pathway

50

.  Also,  melatonin 

has  been  shown  to  be  able  to  reduce  the  osteoblasts  differentiation  time

51

  and  to  increase 

synthesis  of  alkaline  phosphatase

52

,  osteopontin,  osteocalcin  or  procollagen  type  I  C-peptide 

(PICP)

23,50,53,54

, markers for bone formation. 

On the other hand, it has been shown that melatonin can also regulate the bone resorption 

arm  of  bone  remodeling

17,55

.    Indeed,  in  vitro,  in  vivo  and  clinical  studies  demonstrated  that 

melatonin  is  capable  to  reduce  RANKL

45,56,57

  and  increase  OPG

45,56

  expression  by  osteoblasts, 

leading  to  a  net  anabolic  effect  on  bone.    Also,  some  of  our  in  vivo  studies  have  shown  that 

melatonin reduces the mRNA expression of TNF-α and IL-1

58

, markers for osteoclastogenesis. 

Future research 

Findings of our study are the first evidence indicating that melatonin supplement is able to affect 

bone  remodeling  and  biomechanical  properties  in  old  animals.  Accordingly,  future  large-scale 

 Page 9 of 26 

Rejuvenation Research

Melatonin dietary supplement as an anti-aging therapy for age-related bone loss (doi: 10.1089/rej.2013.1542)

This article has been peer-reviewed and accepted for publication, but has yet to undergo copyediting and proof correction. The final published version may differ from this proof.

10

 

10 

 

prospective randomized clinical trials should be conducted in order to investigate melatonin as a 

potential therapy for age-related bone changes.  Moreover, in vivo and clinical studies assessing 

biochemical bone markers and bone density measurements will have to be performed to explore 

the effect of melatonin supplement on bone structure in old population. 

Conclusion:  

Our  findings  demonstrate  that  dietary  melatonin  supplementation  increases  bone  mass  accrual 

and  bone  biomechanical  properties  in  old  male  rats.  These  findings  suggest  that  melatonin 

supplement  could  improve  the  health  of  bones  in  old  population,  although  additional  clinical 

studies are needed to confirm these potentially important findings. 

 

Authors disclosure statement: authors disclose any commercial associations that might create a 

conflict of interest in connection with submitted manuscripts. 

All of authors inform that no competing financial interest exist regarding this manuscript.

 

Page 10 of 26 

Rejuvenation Research

Melatonin dietary supplement as an anti-aging therapy for age-related bone loss (doi: 10.1089/rej.2013.1542)

This article has been peer-reviewed and accepted for publication, but has yet to undergo copyediting and proof correction. The final published version may differ from this proof.